PCR技術(shù)在基層疾控中心實(shí)驗室的應用案例
四川華銳凈化 2019-03-31 13:30:39 閱讀
【摘要】目的 為了具備病毒核酸檢測能力，對流感病毒和手足口病毒進(jìn)行鑒定和分型。方法 1申請資金建立PCR實(shí)驗室；2 RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)在流感和手足口病毒檢測中的應用；結果 1 2009年寧夏吳忠市PCR實(shí)驗室建成投入使用；2流感樣常規監測、暴發(fā)疫情快速確診流感病毒類(lèi)型，熒光定量PCR技術(shù)和雙重熒光定量PCR技術(shù)對手足口病樣核酸鑒定和分型。結論 吳忠市PCR實(shí)驗室的建立，RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)在基層疾控中心實(shí)驗室的運用，吳忠市疾控中心實(shí)驗室首次具備核酸檢測能力，提高了基層實(shí)驗室的技術(shù)能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學(xué)有效的數據，為我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐，也為分子生物學(xué)在基層實(shí)驗室開(kāi)展研究奠定基礎。建立基層PCR實(shí)驗室不盡是基層實(shí)驗室能力建設的一個(gè)巨大飛躍，更是在現代疾病預防控制事業(yè)中起到了巨大的作用。
【關(guān)鍵詞】PCR實(shí)驗室 基層 建立 現狀 應用
PCR技術(shù)是一種快速DNA片段擴增技術(shù)，具有高靈敏性、高特異性、簡(jiǎn)便、快速以及對標本質(zhì)量要求較低的特點(diǎn)，已經(jīng)成為一種對標本中的特定DNA片段進(jìn)行研究和檢測鑒定的重要方法，被廣泛用于病毒學(xué)診斷，尤其是病毒性疾病的早期診斷[1]。Real-time PCR是新研制出的一種核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在RT-PCR基礎上加入熒光標記探針來(lái)實(shí)現其定量功能的，在PCR反應系統中引入了熒光標記探針具有高靈敏性、高特異性和高精確性的特點(diǎn)。PCR 技術(shù)在基層疾控中心的開(kāi)展，提高了基層實(shí)驗室的技術(shù)能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學(xué)有效的數據，為我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐，也為分子生物學(xué)在基層實(shí)驗室開(kāi)展研究奠定基礎，在現代疾病預防控制事業(yè)中起到了巨大的作用。
1 方法
1.1 吳忠市疾控中心申請建立PCR實(shí)驗室。
吳忠市PCR實(shí)驗室的建立有其歷史必要性。2009甲型H1N1流感爆發(fā)引發(fā)的相關(guān)疾病死亡，給人類(lèi)生命財產(chǎn)和社會(huì )經(jīng)濟發(fā)展帶來(lái)災難性的打擊。在當年的5月，還沒(méi)有特效治療的藥物，尚無(wú)有效的預防疫苗，相關(guān)的疫苗研發(fā)正在進(jìn)行之中[2]。甲型H1N1流感疫情的蔓延和流行趨勢，引起全球人民的高度恐慌。我國密切關(guān)注甲型H1N1流感的發(fā)生和傳播，各級疾控中心加強監測和檢測，及時(shí)應對疫情的發(fā)生。面對可能大規模爆發(fā)的流感疫情，我們的實(shí)驗室檢測工作已經(jīng)無(wú)法解決對疫情病毒的確診工作，無(wú)法滿(mǎn)足這種空前危機的局勢,擴大流感檢測實(shí)驗室，應對疫情危機已經(jīng)是迫在眉睫的問(wèn)題。實(shí)驗室檢測是確診流感病例的重要依據，為進(jìn)一步加強疫情監測，嚴防疫情擴散，需逐步將現有流感監測網(wǎng)絡(luò )實(shí)驗室擴大到所有地市級疾病預防控制中心，因此建立基層PCR實(shí)驗室是這種歷史時(shí)期的必然趨勢。
PCR實(shí)驗室是分子生物實(shí)驗室，因其技術(shù)參數條件高，造價(jià)昂貴，開(kāi)展工作耗資巨大，因此很難在基層實(shí)驗室建立。2009年，在特定的歷史時(shí)期，寧夏吳忠市疾控中心積極向上級部門(mén)和地方政府匯報建立PCR實(shí)驗室的必要性，并申請項目資金，申請審批在吳忠市疾控中心建立PCR實(shí)驗室。
1.2 RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)在基層疾控中心實(shí)驗室的運用。
寧夏吳忠市PCR實(shí)驗室按照標準配置了普通PCR擴增儀、定量Real-time實(shí)時(shí)熒光PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、倒置顯微鏡、A2型生物安全柜、B2型生物安全柜、超凈工作臺、低溫冷凍離心機、培養箱、高壓鍋、-70攝氏度低溫冷凍冰箱、純水儀等儀器設備30余件。
在PCR實(shí)驗室建設同時(shí)，吳忠市疾控中心先后派出2名專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員到寧夏自治區疾控中心病毒實(shí)驗室進(jìn)行了專(zhuān)項培訓，通過(guò)考核，獲得了上崗證書(shū)。
2009年11月22日，經(jīng)過(guò)寧夏回族自治區疾控中心專(zhuān)家的現場(chǎng)流感樣盲樣的考核驗收，達標后以RT-PCR技術(shù)開(kāi)展流感核酸檢測工作開(kāi)始正式投入使用，標志著(zhù)PCR技術(shù)首次在基層實(shí)驗室的開(kāi)展。
2 結果
2.1 在國家和地方政府的大力支持下，在單位領(lǐng)導的努力和各位專(zhuān)家的指導下，吳忠市PCR實(shí)驗室于同年11月份建成。
寧夏吳忠市PCR實(shí)驗室嚴格按照生物安全Ⅱ級的要求在市疾控中心進(jìn)行設計和建設。 PCR技術(shù)基本原理就是將感樣本的特異基因組核酸基因片段通過(guò)聚集、提取、擴增，分析其擴增產(chǎn)物來(lái)確定流感病毒的類(lèi)型。完成一組PCR實(shí)驗，通常應經(jīng)過(guò)試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產(chǎn)物分析四個(gè)實(shí)驗過(guò)程[3]。
寧夏吳忠市疾控中心的PCR實(shí)驗室在環(huán)境結構上是組合形式的PCR實(shí)驗室，是指完成PCR四個(gè)實(shí)驗過(guò)程的實(shí)驗和用房是相鄰布置的，組成獨立實(shí)驗區域的形式。實(shí)驗室設有PCR內部專(zhuān)用走廊。實(shí)驗室間有試劑配制室、樣品處理室、核酸擴增室及核酸擴增產(chǎn)物分析室組成。各室在入口處設置有緩沖間，以減少室內外空氣交換。我中心的PCR實(shí)驗室是通過(guò)獨立的送排風(fēng)系統，控制氣流方向和壓差，氣流由清潔區流向污染區 。
2.2 目前，吳忠市PCR實(shí)驗室運用RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)承擔來(lái)自哨點(diǎn)醫院（吳忠市人民醫院）的發(fā)熱病人的流感樣樣本的常規檢測，同時(shí)還擔負著(zhù)整個(gè)吳忠市轄區暴發(fā)集體發(fā)熱疫情的現場(chǎng)快速檢測及實(shí)驗室確診檢測工作，確診流感病毒類(lèi)型及分型。運用Real-time PCR技術(shù)和雙重Real-time PCR技術(shù)對本手足口病樣核酸鑒定和分型。對流感樣和手足口病樣核酸檢測，吳忠市PCR實(shí)驗室檢測的陽(yáng)性樣品，全部都及時(shí)送到寧夏回族自治區疾控中心病毒科實(shí)驗室復核，結果一致，沒(méi)有出現結果異?；蛘呤遣环锨闆r。國家流感中心在2009年10月和2010年10月，兩次組織對國家流感網(wǎng)絡(luò )絡(luò )實(shí)驗室分別進(jìn)行為數10份的流感盲樣標本分型考核，盲樣考核樣品由國家流感中心統一提供。吳忠市疾控中心流感網(wǎng)絡(luò )實(shí)驗室的考核盲樣結果符合率均為100%，順利通過(guò)，這是對工作人員盡快掌握RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)的肯定。吳忠市PCR實(shí)驗室自建成開(kāi)展工作以來(lái)，無(wú)安全事故發(fā)生，沒(méi)有檢測結果錯誤情況，一切運轉正常。
3 結論：
3.1 吳忠市PCR實(shí)驗室運用RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)檢測包括甲型H1N1流感在內的各種流感病毒核酸，及時(shí)確診流感病毒的類(lèi)型及其亞型，為流感疫情的流行水平和變化趨勢提供科學(xué)有效的數據，為提高我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐。
3.2 在吳忠市PCR實(shí)驗室運用熒光定量PCR技術(shù)和雙重熒光定量PCR技術(shù)檢測手足口病核酸分型，暴發(fā)疫情快速確診腸道病毒類(lèi)型，掌握EV71和CoxA16感染流行特征，為疫情的流行水平和變化趨勢提供科學(xué)有效的數據，同時(shí)為臨床診斷以及制定預防措施提供依據。
3.3 吳忠市PCR實(shí)驗室，作為一個(gè)分子診斷實(shí)驗室，能夠為將來(lái)開(kāi)展PCR技術(shù)支持的任何其它病毒核酸檢測提供實(shí)驗環(huán)境，在今后的發(fā)展中將會(huì )發(fā)揮其最大效應，也許在不久的將來(lái)，丙肝病毒、艾滋病毒、乙腦病毒、輪狀病毒、流感病毒、麻疹病毒、腺病毒、EB病毒、風(fēng)疹病毒等需要PCR技術(shù)支持病毒核酸檢測都能夠在吳忠市疾控中心這樣的基層PCR實(shí)驗室完成。PCR技術(shù)在吳忠市疾控中心實(shí)驗室的運用，提高了實(shí)驗室的技術(shù)能力，也為分子生物學(xué)在基層實(shí)驗室開(kāi)展研究奠定基礎。。
寧夏吳忠市PCR實(shí)驗室的建成啟用，極大地提高了我市流感傳染病和手足口病診斷的及時(shí)性和準確性，對有效預防控制流感病毒和手足口病傳染病發(fā)揮重要的指導性作用。RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)在基層疾控中心實(shí)驗室的運用，吳忠市疾控中心實(shí)驗室首次具備核酸檢測能力，提高了基層實(shí)驗室的技術(shù)能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學(xué)有效的數據，為我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐，也為分子生物學(xué)在基層實(shí)驗室開(kāi)展研究奠定基礎。建立基層PCR實(shí)驗室不盡是基層實(shí)驗室能力建設的一個(gè)巨大飛躍，更是在現代疾病預防控制事業(yè)中起到了巨大的作用。
【關(guān)鍵詞】PCR實(shí)驗室 基層 建立 現狀 應用
PCR技術(shù)是一種快速DNA片段擴增技術(shù)，具有高靈敏性、高特異性、簡(jiǎn)便、快速以及對標本質(zhì)量要求較低的特點(diǎn)，已經(jīng)成為一種對標本中的特定DNA片段進(jìn)行研究和檢測鑒定的重要方法，被廣泛用于病毒學(xué)診斷，尤其是病毒性疾病的早期診斷[1]。Real-time PCR是新研制出的一種核酸定量技術(shù)，該技術(shù)是在RT-PCR基礎上加入熒光標記探針來(lái)實(shí)現其定量功能的，在PCR反應系統中引入了熒光標記探針具有高靈敏性、高特異性和高精確性的特點(diǎn)。PCR 技術(shù)在基層疾控中心的開(kāi)展，提高了基層實(shí)驗室的技術(shù)能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學(xué)有效的數據，為我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐，也為分子生物學(xué)在基層實(shí)驗室開(kāi)展研究奠定基礎，在現代疾病預防控制事業(yè)中起到了巨大的作用。
1 方法
1.1 吳忠市疾控中心申請建立PCR實(shí)驗室。
吳忠市PCR實(shí)驗室的建立有其歷史必要性。2009甲型H1N1流感爆發(fā)引發(fā)的相關(guān)疾病死亡，給人類(lèi)生命財產(chǎn)和社會(huì )經(jīng)濟發(fā)展帶來(lái)災難性的打擊。在當年的5月，還沒(méi)有特效治療的藥物，尚無(wú)有效的預防疫苗，相關(guān)的疫苗研發(fā)正在進(jìn)行之中[2]。甲型H1N1流感疫情的蔓延和流行趨勢，引起全球人民的高度恐慌。我國密切關(guān)注甲型H1N1流感的發(fā)生和傳播，各級疾控中心加強監測和檢測，及時(shí)應對疫情的發(fā)生。面對可能大規模爆發(fā)的流感疫情，我們的實(shí)驗室檢測工作已經(jīng)無(wú)法解決對疫情病毒的確診工作，無(wú)法滿(mǎn)足這種空前危機的局勢,擴大流感檢測實(shí)驗室，應對疫情危機已經(jīng)是迫在眉睫的問(wèn)題。實(shí)驗室檢測是確診流感病例的重要依據，為進(jìn)一步加強疫情監測，嚴防疫情擴散，需逐步將現有流感監測網(wǎng)絡(luò )實(shí)驗室擴大到所有地市級疾病預防控制中心，因此建立基層PCR實(shí)驗室是這種歷史時(shí)期的必然趨勢。
PCR實(shí)驗室是分子生物實(shí)驗室，因其技術(shù)參數條件高，造價(jià)昂貴，開(kāi)展工作耗資巨大，因此很難在基層實(shí)驗室建立。2009年，在特定的歷史時(shí)期，寧夏吳忠市疾控中心積極向上級部門(mén)和地方政府匯報建立PCR實(shí)驗室的必要性，并申請項目資金，申請審批在吳忠市疾控中心建立PCR實(shí)驗室。
1.2 RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)在基層疾控中心實(shí)驗室的運用。
寧夏吳忠市PCR實(shí)驗室按照標準配置了普通PCR擴增儀、定量Real-time實(shí)時(shí)熒光PCR儀、電泳儀、凝膠成像儀、倒置顯微鏡、A2型生物安全柜、B2型生物安全柜、超凈工作臺、低溫冷凍離心機、培養箱、高壓鍋、-70攝氏度低溫冷凍冰箱、純水儀等儀器設備30余件。
在PCR實(shí)驗室建設同時(shí)，吳忠市疾控中心先后派出2名專(zhuān)業(yè)技術(shù)人員到寧夏自治區疾控中心病毒實(shí)驗室進(jìn)行了專(zhuān)項培訓，通過(guò)考核，獲得了上崗證書(shū)。
2009年11月22日，經(jīng)過(guò)寧夏回族自治區疾控中心專(zhuān)家的現場(chǎng)流感樣盲樣的考核驗收，達標后以RT-PCR技術(shù)開(kāi)展流感核酸檢測工作開(kāi)始正式投入使用，標志著(zhù)PCR技術(shù)首次在基層實(shí)驗室的開(kāi)展。
2 結果
2.1 在國家和地方政府的大力支持下，在單位領(lǐng)導的努力和各位專(zhuān)家的指導下，吳忠市PCR實(shí)驗室于同年11月份建成。
寧夏吳忠市PCR實(shí)驗室嚴格按照生物安全Ⅱ級的要求在市疾控中心進(jìn)行設計和建設。 PCR技術(shù)基本原理就是將感樣本的特異基因組核酸基因片段通過(guò)聚集、提取、擴增，分析其擴增產(chǎn)物來(lái)確定流感病毒的類(lèi)型。完成一組PCR實(shí)驗，通常應經(jīng)過(guò)試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產(chǎn)物分析四個(gè)實(shí)驗過(guò)程[3]。
寧夏吳忠市疾控中心的PCR實(shí)驗室在環(huán)境結構上是組合形式的PCR實(shí)驗室，是指完成PCR四個(gè)實(shí)驗過(guò)程的實(shí)驗和用房是相鄰布置的，組成獨立實(shí)驗區域的形式。實(shí)驗室設有PCR內部專(zhuān)用走廊。實(shí)驗室間有試劑配制室、樣品處理室、核酸擴增室及核酸擴增產(chǎn)物分析室組成。各室在入口處設置有緩沖間，以減少室內外空氣交換。我中心的PCR實(shí)驗室是通過(guò)獨立的送排風(fēng)系統，控制氣流方向和壓差，氣流由清潔區流向污染區 。
2.2 目前，吳忠市PCR實(shí)驗室運用RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)承擔來(lái)自哨點(diǎn)醫院（吳忠市人民醫院）的發(fā)熱病人的流感樣樣本的常規檢測，同時(shí)還擔負著(zhù)整個(gè)吳忠市轄區暴發(fā)集體發(fā)熱疫情的現場(chǎng)快速檢測及實(shí)驗室確診檢測工作，確診流感病毒類(lèi)型及分型。運用Real-time PCR技術(shù)和雙重Real-time PCR技術(shù)對本手足口病樣核酸鑒定和分型。對流感樣和手足口病樣核酸檢測，吳忠市PCR實(shí)驗室檢測的陽(yáng)性樣品，全部都及時(shí)送到寧夏回族自治區疾控中心病毒科實(shí)驗室復核，結果一致，沒(méi)有出現結果異?；蛘呤遣环锨闆r。國家流感中心在2009年10月和2010年10月，兩次組織對國家流感網(wǎng)絡(luò )絡(luò )實(shí)驗室分別進(jìn)行為數10份的流感盲樣標本分型考核，盲樣考核樣品由國家流感中心統一提供。吳忠市疾控中心流感網(wǎng)絡(luò )實(shí)驗室的考核盲樣結果符合率均為100%，順利通過(guò)，這是對工作人員盡快掌握RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)的肯定。吳忠市PCR實(shí)驗室自建成開(kāi)展工作以來(lái)，無(wú)安全事故發(fā)生，沒(méi)有檢測結果錯誤情況，一切運轉正常。
3 結論：
3.1 吳忠市PCR實(shí)驗室運用RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)檢測包括甲型H1N1流感在內的各種流感病毒核酸，及時(shí)確診流感病毒的類(lèi)型及其亞型，為流感疫情的流行水平和變化趨勢提供科學(xué)有效的數據，為提高我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐。
3.2 在吳忠市PCR實(shí)驗室運用熒光定量PCR技術(shù)和雙重熒光定量PCR技術(shù)檢測手足口病核酸分型，暴發(fā)疫情快速確診腸道病毒類(lèi)型，掌握EV71和CoxA16感染流行特征，為疫情的流行水平和變化趨勢提供科學(xué)有效的數據，同時(shí)為臨床診斷以及制定預防措施提供依據。
3.3 吳忠市PCR實(shí)驗室，作為一個(gè)分子診斷實(shí)驗室，能夠為將來(lái)開(kāi)展PCR技術(shù)支持的任何其它病毒核酸檢測提供實(shí)驗環(huán)境，在今后的發(fā)展中將會(huì )發(fā)揮其最大效應，也許在不久的將來(lái)，丙肝病毒、艾滋病毒、乙腦病毒、輪狀病毒、流感病毒、麻疹病毒、腺病毒、EB病毒、風(fēng)疹病毒等需要PCR技術(shù)支持病毒核酸檢測都能夠在吳忠市疾控中心這樣的基層PCR實(shí)驗室完成。PCR技術(shù)在吳忠市疾控中心實(shí)驗室的運用，提高了實(shí)驗室的技術(shù)能力，也為分子生物學(xué)在基層實(shí)驗室開(kāi)展研究奠定基礎。。
寧夏吳忠市PCR實(shí)驗室的建成啟用，極大地提高了我市流感傳染病和手足口病診斷的及時(shí)性和準確性，對有效預防控制流感病毒和手足口病傳染病發(fā)揮重要的指導性作用。RT-PCR技術(shù)和Real-time PCR技術(shù)在基層疾控中心實(shí)驗室的運用，吳忠市疾控中心實(shí)驗室首次具備核酸檢測能力，提高了基層實(shí)驗室的技術(shù)能力，為流行病疫情的流行水平和變化趨勢提供科學(xué)有效的數據，為我市的疾病防控工作能力提供了技術(shù)支撐，也為分子生物學(xué)在基層實(shí)驗室開(kāi)展研究奠定基礎。建立基層PCR實(shí)驗室不盡是基層實(shí)驗室能力建設的一個(gè)巨大飛躍，更是在現代疾病預防控制事業(yè)中起到了巨大的作用。
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