PCR基因擴增實(shí)驗室介紹和標準：
   PCR實(shí)驗室又叫基因擴增實(shí)驗室。PCR是聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction)的簡(jiǎn)稱(chēng)。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，生物體外的特殊DNA復制。通過(guò)DNA基因追蹤系統，能迅速掌握患者體內的病毒含量，其精確度高達納米級別。
PCR實(shí)驗室必須建立嚴格的實(shí)驗室管理制度、建立標準化操作程序（SOP）、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實(shí)驗室日常運行符合國家衛生部的要求，確保檢測結果準確、確保實(shí)驗室衛生安全，確保實(shí)驗室長(cháng)期穩定運行.
                     

PCR設計規范 /PRINCIPLES

配置原則	室全PCR線(xiàn)實(shí)驗(高檔實(shí)驗室)	標準PCR實(shí)驗室（中檔實(shí)驗室）	普通實(shí)驗室（普通實(shí)驗室）	測序實(shí)驗室（專(zhuān)科實(shí)驗室）
開(kāi)展項目	涵蓋了目前分子生物學(xué)能開(kāi)展所有項目，達到國內甚至國際一流CR實(shí)驗室水平。	檢測項目齊全，涵蓋了目前臨床需求的常規檢測項目，達到國內PCR標準實(shí)驗室的檢測水平。	臨床科室或小型醫院開(kāi)展PCR項目，檢測項目滿(mǎn)足臨床需求，達到或達不到國內PCR標準實(shí)驗室的標準。	開(kāi)展測序的所有檢測項目，達到標準PCR實(shí)驗室水平
項目先進(jìn)性	除開(kāi)展常規的檢測項目外，還需開(kāi)展高端項目，如測序項目、超敏PCR項目、腫瘤檢測等高端項目。	開(kāi)展項目技術(shù)性能基本滿(mǎn)足臨床需求，達到國內PCR標準實(shí)驗室的檢測水平。	開(kāi)展項目技術(shù)性只能滿(mǎn)足科室或小型醫院的當前需求，不具有先進(jìn)性。	國內外最先進(jìn)的PCR測序檢測項目，達到個(gè)體化診療的需求。
人員要求	至少有兩人，除經(jīng)過(guò)普通PCR上崗培訓外，要具有測序項目檢測實(shí)驗及結果分析能力。	至少有兩人，除經(jīng)過(guò)普通PCR上崗培訓外，要具有測序項目檢測實(shí)驗及結果分析能力。	至少有兩人，除經(jīng)過(guò)普通PCR上崗培訓外，要具有測序項目檢測實(shí)驗及結果分析能力。	至少有兩人，除經(jīng)過(guò)普通PCR上崗培訓外，要具有測序項目檢測實(shí)驗及結果分析能力。

 
PCR基因擴增實(shí)驗室技術(shù)參數：
    

區域	壓力	溫度	相對濕度	照明
PCR走廊	+5-0Pa	20-26度	40-60%RH	主實(shí)驗室≥300LX，其余房間20-300LX
PCR試劑準備區	+10Pa
PCR樣品制備區	+15Pa
PCR擴增及擴增產(chǎn)物分析區	-15-250Pa

 
如使用全自動(dòng)分析儀，區域可適當合并。
2） 各工作區域必須有明確的標記，避免不同工作區域內的設備、物品混用。
3） 進(jìn)入各工作區域必須嚴格按照單一方向進(jìn)行，即試劑儲存和準備區 —>標本制備區—>擴增反應混合物配制和擴增區—>擴增產(chǎn)物分析區。
4） 不同的工作區域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開(kāi)各工作區域時(shí)，不得將工作服帶出。
     

PCR擴增檢驗實(shí)驗室原則上分為三個(gè)單獨的工作區域：試劑貯存和準備區、標本制備區、擴增和擴增產(chǎn)物分析區。為避免交叉污染，進(jìn)入各個(gè)工作區域必須嚴格遵循單一方向進(jìn)行，即只能從試劑貯存和準備區→標本制備區→擴增和擴增產(chǎn)物分析區。各實(shí)驗區之間的試劑及樣品傳遞應通過(guò)傳遞窗進(jìn)行。
(1)試劑貯存和準備區
該實(shí)驗區主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應混合液的制備。試劑和用于樣品制作的材料應直接運送至該區，不得經(jīng)過(guò)其他區域。試劑原材料必須貯存在本區內，并在本區內制備成所需的貯存試劑。對與氣流壓力的控制，本區應對外界保持微正壓。
(2)標本制備區
該區域主要進(jìn)行的操作為樣本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴增反應管和測定DNA的合成。本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為正壓，以避免從鄰近區進(jìn)入本區的氣溶膠污染。另外，由于在加樣操作中可能會(huì )發(fā)生氣溶膠所致的污染，所以應避免在本區內不必要的走動(dòng)。
(3-4)擴增和擴增產(chǎn)物分析區
　　該區域主要進(jìn)行的操作為DNA擴增和擴增片段的測定。此外，已制備的DNA模板(來(lái)自樣本制備區)的加入和主反應混合液(來(lái)自試劑貯存和制備區)制備成反應混合液等也可在本區內進(jìn)行。本區的壓力梯度要求為：相對于鄰近區域為負壓，以避免氣溶膠從本區漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應盡量減少在本區內的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應在超凈臺內進(jìn)行。
   PCR區完成以后，需要分析樣品并解釋數據，應該留出一個(gè)專(zhuān)門(mén)用于反應后處理樣品的地方。后PCR活動(dòng)中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專(zhuān)門(mén)用于這一目的，決不能把實(shí)驗室這一區域的試劑或儀器用于任何前PCR活動(dòng)。產(chǎn)物分析區如使用全自動(dòng)分析儀，區域可適當合并。
(5)緩沖區與沖洗區
整個(gè)區域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨立實(shí)驗區設置有緩沖區，同時(shí)各區通過(guò)氣壓調節，使整個(gè)PCR實(shí)驗過(guò)程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
    可打開(kāi)緩沖區Ⅰ，緩沖區Ⅱ和 PCR 擴增區的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗區的外墻上和各扇門(mén)上都安裝有風(fēng)量可調的回風(fēng)口，空氣通過(guò)回風(fēng)口向室內換氣。外面有用于實(shí)驗后消毒，消毒區域有專(zhuān)用清洗液和專(zhuān)用潔凈洗手池，以及消毒紙巾。
    若房間進(jìn)深允許，可設PCR內部專(zhuān)用走廊。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面，緩沖間比專(zhuān)用走廊更有意義。
    各個(gè)區域之間應具備單向的實(shí)驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實(shí)驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實(shí)驗過(guò)程造成污染產(chǎn)生假性結果。 


 
PCR實(shí)驗室案例欣賞

---

以下為四川華銳凈化設計的疾控中心PCR基因擴增實(shí)驗室的整體建設： 
1、主體結構：
主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內所有陰角、陽(yáng)角均采用鋁合金50內圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問(wèn)題。結構牢固，線(xiàn)條簡(jiǎn)明，美觀(guān)大方，密封性好。
 2、 標準的三區分隔和氣壓調節：
將PCR過(guò)程分成試劑準備、標本制備和PCR擴增、分析三個(gè)（或）四個(gè)獨立的實(shí)驗區。整個(gè)區域有一個(gè)整體緩沖走廊。每個(gè)獨立實(shí)驗區設置有緩沖區，同時(shí)各區通過(guò)氣壓調節，使整個(gè)PCR實(shí)驗過(guò)程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
可打開(kāi)緩沖區Ⅰ，緩沖區Ⅱ和 PCR 擴增區的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗區的外墻上和各扇門(mén)上都安裝有風(fēng)量可調的回風(fēng)口，空氣通過(guò)回風(fēng)口向室內換氣。
 3、 消毒：
在三個(gè)實(shí)驗區和三個(gè)緩沖區頂部以及傳送窗內部安裝有紫外燈，供消毒用。 在試劑準備區和標本制備區 還設置移動(dòng)紫外線(xiàn)燈，對實(shí)驗桌進(jìn)行局部消毒。
4、 機械連鎖不銹鋼傳遞窗：
試劑和標本通過(guò)機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過(guò)程中不受污染（人物分流）。
5、 地面
地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒(méi)有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。
 6、 照明
燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。
   PCR通風(fēng)與消防區 （不同區域工作人員衣服不同）                    PCR負壓控制區

在建設的過(guò)程中應注意：
●規范的安裝流程和全面的服務(wù)流程。
●嚴格按照規范科學(xué)設計的安裝流程。
●安裝前需要確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進(jìn)線(xiàn)位置，電話(huà)網(wǎng)絡(luò )線(xiàn)進(jìn)線(xiàn)位置，進(jìn)水水壓，最小安裝空間，地面平整度，通風(fēng)孔、進(jìn)水管和下水管的位置等，理想狀態(tài)的空間尺寸和通風(fēng)口尺寸。 
PCR 即聚合酶鏈式反應，是分子生物學(xué)研究和實(shí)驗的常規方法，也是生物學(xué)、醫學(xué)臨床等領(lǐng)域廣泛應用的實(shí)驗技術(shù)。其特點(diǎn)是能將微量的DNA大幅增加。實(shí)驗室分為四個(gè)區域，進(jìn)入各工作區域必須嚴格按照單一方向進(jìn)行，不同的工作區域使用不同的工作服（例如不同的顏色）。工作人員離開(kāi)各工作區域時(shí)，不得將工作服帶出，
PCR整體實(shí)驗室區域分別為：
 1.試劑配制區?
 2.樣品處理區?
 3.核酸擴增區?
PCR實(shí)驗室可以是分散形式，也可以是組合形式。完成一組PCR實(shí)驗，通常應經(jīng)過(guò)試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產(chǎn)物分析四個(gè)實(shí)驗過(guò)程，若實(shí)驗工藝需要，還應增加樣品粉碎過(guò)程。
一、分散形式PCR實(shí)驗室
    所謂分散形式PCR實(shí)驗室，是指完成上述實(shí)驗過(guò)程的實(shí)驗用房彼此相距較遠，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR實(shí)驗室，由于各個(gè)實(shí)驗之間不易相互干擾，因此無(wú)需特殊條件要求。
二、組合形式PCR實(shí)驗室
    所謂組合形式PCR實(shí)驗室, 是指完成PCR四個(gè)實(shí)驗過(guò)程的實(shí)驗用房相鄰布置，組成獨立實(shí)驗區域的形式。對于組合形式PCR實(shí)驗室，由于各個(gè)實(shí)驗間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對總體布局以及屏障系統具有一定的要求。各室在入口處設緩沖間，以減少室內外空氣交換。試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染；核酸擴增室及產(chǎn)物分析室應呈微負壓，以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品。
如果使用熒光PCR儀，擴增室和產(chǎn)物分析室可以合并。
    若房間進(jìn)深允許，可設PCR內部專(zhuān)用走廊。需要指出的是在減少室內外空氣交換方面，緩沖間比專(zhuān)用走廊更有意義。
    各個(gè)區域之間應具備單向的實(shí)驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實(shí)驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實(shí)驗過(guò)程造成污染產(chǎn)生假性結果。  
實(shí)驗室的墻體，包括頂棚，應結構牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線(xiàn)條過(guò)渡；墻體內壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應滿(mǎn)足無(wú)縫隙、無(wú)滲漏、光潔、耐腐蝕的要求.
PCR實(shí)驗室設置和驗收
  擬設置臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室的醫療機構按照《臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室基本設置標準》籌建實(shí)驗室；籌建完成后，由法定代表人向衛生部臨檢中心提出技術(shù)驗收申請。
申請時(shí)需提交以下材料：
（一）《醫療機構執業(yè)許可證》復印件；
（二）可行性研究報告；
1、 擬設臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室機構的所在地醫療衛生資源狀況、本機構的基本情況、對臨床基因擴增檢驗的需求以及臨床基因擴增實(shí)驗室運行的預測分析；
2、 擬設臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室的設置平面圖；
3、 擬設臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室將開(kāi)展的檢驗項目、實(shí)驗設備條件和有關(guān)技術(shù)人員資料
PCR實(shí)驗室驗收條件：
1 根據衛生部臨檢中心規定，凡是根據需要開(kāi)展PCR檢測實(shí)驗室建設的醫療機構均通過(guò)衛生臨床檢驗中心實(shí)驗室驗收并取得合格證書(shū)方可開(kāi)展工作。二級以上醫院方可設立PCR實(shí)驗室，含專(zhuān)科醫院。
2驗收規定：
三級醫院由衛生部臨床檢驗中心組織專(zhuān)家（一般均為各省臨床檢驗中心主任）進(jìn)行，二級醫院由各個(gè)省臨床檢驗中心組織專(zhuān)家（一般為本省醫療機構主任級別專(zhuān)家）進(jìn)行驗收。按照《臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室基本設置標準》對提出申請的臨床基因擴增檢驗實(shí)驗室進(jìn)行技術(shù)驗收。驗收完成后，在20日內將驗收報告寄送至申請機構。
驗收人員組成：一個(gè)驗收小組一般為3人，其中一人為聯(lián)絡(luò )小組組長(cháng)，其他為其他省臨床檢驗中心主任或者本省醫院內任職專(zhuān)家。
PCR實(shí)驗室所在科室規定：根據規定，PCR檢測應該由各醫院的檢驗科開(kāi)展，其他科室如傳染科，皮膚科等，要求開(kāi)展并申請驗收的，應該事先由各省臨床檢驗中心認可。
PCR實(shí)驗室人員規定：根據規定，PCR實(shí)驗室操作人員至少2名，且有PCR上崗培訓合格證。
PCR實(shí)驗室設備：PCR實(shí)驗室內所需要的醫療設備均需要取得相關(guān)醫療器械注冊許可證，檢測試劑均需要取得新藥證書(shū)和藥品生產(chǎn)文號，熒光定量PCR不得使用超過(guò)五年。
PCR實(shí)驗室認證實(shí)施規定：
PCR實(shí)驗室認證驗收時(shí)，均會(huì )給定未知標本5份（一般是HBV-DNA，可能是近一兩年的衛生部臨床檢驗中心室間質(zhì)控品），要求待認證實(shí)驗室做實(shí)驗并打印報告單作為驗收的重要實(shí)驗依據。一般要求5份標本的定量結果必須在范圍值之內，否則不合格。
PCR實(shí)驗室各區域管理規定：

---

試劑準備區工作制度  
 一、實(shí)驗人員進(jìn)入該區須更換工作服，穿本區專(zhuān)用綠色工作服， 戴帽子、口罩及更換專(zhuān)用拖鞋。 
二、實(shí)驗員在試劑準備區接收標本、準備實(shí)驗用的試劑。
 三、實(shí)驗員每天收齊標本，驗收登記后，將標本通過(guò)傳遞 窗送入標本制備區。  四、在試劑準備區配置好試劑后放入冰箱內備用。需要時(shí) 通過(guò)傳遞窗送入標本制備區。 
五、每天的標本及配置的試劑須登記記錄，應書(shū)寫(xiě)工整詳 細，使用本區專(zhuān)用的、帶有本室標識的記錄本、紙和筆。
 六、將本區廢棄物裝入本室垃圾袋中，有專(zhuān)人將垃圾帶出 實(shí)驗室交醫院集中處理。
 七、實(shí)驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實(shí)驗臺 面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。    
 標本制備區工作制度   
 一、實(shí)驗人員進(jìn)入該區須更換工作服，穿上本區專(zhuān)用藍色工作服， 戴帽子、口罩及更換專(zhuān)用拖鞋。
 二、把已準備好的試劑放入冰箱試劑存放專(zhuān)區暫存。
 三、記錄溫濕度計讀數、冰箱的溫度。
 四、嚴格按照SOP文件及試劑盒要求進(jìn)行實(shí)驗操作，加樣好的PCR 管須通過(guò)傳遞窗送入擴增及產(chǎn)物區。
 五、使用本區專(zhuān)用的移液器及吸頭，使用過(guò)的離心管、吸頭須置于 盛有含氯消毒液的廢液缸中，實(shí)驗完畢后及時(shí)處理。將本區廢棄物裝入本室垃圾袋中，有專(zhuān)人將垃圾帶出實(shí)驗室交醫院集中處理。
 六、使用本區專(zhuān)用的帶有本區標識的記錄本、紙和筆，其他區的用 品不得帶入本區。 
七、實(shí)驗完畢關(guān)閉所有儀器，記錄儀器使用時(shí)間和運行狀態(tài)。
 八、實(shí)驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實(shí)驗臺 面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。    
擴增及產(chǎn)物分析區工作制度  
  一、實(shí)驗人員進(jìn)入該區須更換工作服，穿上本區專(zhuān)用粉紅色 工作服，戴帽子、口罩及更換專(zhuān)用拖鞋。
 二、記錄溫濕度計讀數、冰箱的溫度。
 三、本區主要進(jìn)行目的基因的擴增及分析，須熟悉各擴增儀 的使用，擴增分析完后，記錄結果。
 四、得到當天室內質(zhì)控結果后，及時(shí)記錄在室內質(zhì)控圖上并 進(jìn)行分析。
 五、試驗完畢后關(guān)掉擴增儀，記錄儀器使用時(shí)間和運行狀態(tài)。
 六、每周由實(shí)驗室負責人對進(jìn)行清潔維護并記錄。
 七、擴增分析完后的反應管，須裝入本室垃圾袋中，有專(zhuān)人 將垃圾帶出實(shí)驗室交醫院集中處理。 
八、使用本區專(zhuān)用的帶有本區標識的記錄本、紙和筆，其他區的用 品不得帶入本區。
 九、實(shí)驗后須使用含氯消毒液及75%的乙醇擦拭實(shí)驗臺面，紫外燈消毒30分鐘，記錄紫外燈、冰箱、離心機等儀器的使用情況。